<div>Dear Gromacs users,</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>Thanks for earlier help on this problem.</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>I have tried a number of approaches with varying results (all bad, unfortunately).&nbsp; I am trying to add two&nbsp;CA2+ ions to my protein (1k9p), but when I did this genion put the two CA2+ ions very close together and they flew apart.&nbsp; Then I tried putting only one CA2+, thinking that it would stay put.&nbsp;&nbsp;After I&nbsp;ran an energy minimization, the CA2+&nbsp;ended up outside of the box.&nbsp; Now I am really perplexed.&nbsp; What could be causing this behavior?&nbsp; One thing I haven&#39;t tried yet is&nbsp;adding a few CL- ions to make the box neutral .. somehow I don&#39;t feel this is the problem though since I&#39;ve run non-neutral analyses before without such disastrous consequences.&nbsp;&nbsp;
</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>Could anyone give me some advice?&nbsp; I&#39;m at my wit&#39;s end.&nbsp; I am attaching my script below.&nbsp; Basically fws_ca.pdb is fine, but fws_b4ion.pdb has CA2+ outside of the water box.&nbsp; The water in the water box looks like ice cubes in an ice cube tray, segregated into regular little mini-boxes.&nbsp; I presume the latter is a numerical consequence of the CA2+ flying out of the box.&nbsp; 
</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>Many thanks for any help..</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>Peggy</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>pdb2gmx -ignh -ff gmx -f 1K9P.pdb -p fws.top -o fws.pdb<br><br># add water<br>editconf -bt cubic -f fws.pdb -o fws.pdb -c -d 0.9<br>genbox -cp fws.pdb -cs spc216.gro -o fws_b4em.pdb -p fws.top<br><br># energy minimization
<br>grompp -f minim.mdp -c fws_b4em.pdb -p fws.top -o fws_em.tpr<br>echo &quot;check 2&quot;<br>mdrun -v -s fws_em.tpr -o fws_em.trr -c fws_b4ca.pdb -g em.log -e em.edr<br><br><br># add calcium<br>grompp -f minim.mdp -c fws_b4ca.pdb -p 
fws.top -o fws_ca.tpr<br><br>echo &quot;12&quot; | genion -s fws_ca.tpr -o fws_ca.pdb -pname Ca -np 1 -g fws_ca.log -norandom<br><br>awk &#39;{if ($1 == &quot;SOL&quot;) {print &quot;Ca&nbsp; 1&quot;; print &quot;SOL 7280&quot;}&nbsp; else {print $0;}}&#39; 
fws.top &gt; temp.top<br><br>mv temp.top fws.top <br><br># energy minimization<br>grompp -f minim.mdp -c fws_ca.pdb -p fws.top -o fws_em2.tpr<br>mdrun -v -s fws_em2.tpr -o fws_em2.trr -c fws_b4ion.pdb -g em.log -e em.edr</div>

<div>&nbsp;</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>&nbsp;</div>
<div>&nbsp;</div>